細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),，原來(lái)是Lipofectamine2000過期了。換了之后,，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，盡量使用開封半年內(nèi)的,，因?yàn)檫^了半年后,，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降,。千萬(wàn)不要為了省錢,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清,，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡,。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn),，其實(shí)也可以在原來(lái)的無(wú)血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。這個(gè)時(shí)候，較好不要換液,，不要打擾細(xì)胞,，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清,。過早的話,，會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。合肥昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩,。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次,。5.加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),。6.到時(shí)后,，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)~上海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買能與核酸的磷酸根通過靜電作用,，將DNA分子包裹入內(nèi),。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1.脂質(zhì)體法。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi),。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同,，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物,，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞,。脂質(zhì)體法始于1987年,，此法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較大提高,。陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高,，對(duì)不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。2.非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,。較新的納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑,，如Entranster試劑，納米材料,，細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高，漸漸成為各大實(shí)驗(yàn)室的選擇轉(zhuǎn)染試劑,。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基中的物品物品,，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞,。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品。這樣,，在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞,。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,，因?yàn)檫@些物品是GENETICIN選擇性物品的競(jìng)爭(zhēng)性克制劑,。另外，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量,。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物,。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性,。比如，新鮮融化的NIH3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率,，融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率,。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果,。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn),。

如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便,，對(duì)細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜,，在水相中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的球形封閉囊泡,。脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí),，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體（endosomes）進(jìn)入細(xì)胞，通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,，增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓,，使內(nèi)體結(jié)構(gòu)破壞，釋放出核酸,。隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),。對(duì)于普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法,。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素,，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要,。代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是較佳選擇。上海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買

總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。合肥昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1..電穿孔法,。通過短暫的高電場(chǎng)電脈沖處理細(xì)胞，沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔,。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的,。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,，因?yàn)檫^高的場(chǎng)強(qiáng)和過長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞,，且不需要另外采購(gòu)特殊試劑,，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,，因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高,。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染,。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中,，經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌，再進(jìn)行傳染,。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,，尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、細(xì)胞,。缺點(diǎn)是構(gòu)建細(xì)菌周期長(zhǎng),，環(huán)節(jié)多，易出錯(cuò),，費(fèi)用也高合肥昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑