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雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全,。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,，只需分光即可,。進口2P...

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個波長較短的光子,；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的,。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域,；因為信號背景比高,，所以具有更高的對比度；由于激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā),、光毒性小的特點；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全。由于其非侵入性和高分辨率的特點,，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué),、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具,。美國布魯...

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準雙光子熒光顯微...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后,，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小、使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究,。以小鼠顱內(nèi)成像為優(yōu)勢，可觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞,、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞,、周細胞、血管,、轉(zhuǎn)移瘤細胞,、膠質(zhì)瘤細胞等的變化情況，在**學(xué),、神經(jīng)生物學(xué),、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)退行性疾病等...

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說,，每個時刻,，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,，一個個點的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少剛好雙光...

在2020年12月22日，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進展”和“中國科學(xué)進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu),、蛋白...

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率,。雙光子顯微鏡在組...

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu),、蛋白...

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎,？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進行定點,、觀察,！由于電磁波的波長越短，粒子性越強,，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性,。除此之外,，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率,，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中,，它能對樣品進行三維觀察,。國內(nèi)ultima雙光子顯微鏡商家剛好雙光子在...

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。進口inv...

1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。這種雙...

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊,?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光...

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。雙光子...

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成...

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高,，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力，可以進行三維成像,、動態(tài)成像等,。然而，***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達檢測器,。若要提高信號強度，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加,。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下,。上海雙光子顯微...

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收,。也就是說，每個時刻,，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,，一個個點的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信...

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量...

系統(tǒng)示意圖如圖1所示,，紅外激光束從藍寶石激光器出射后，由一個光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段,，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復(fù)頻率80MHz,，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束,。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號,。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤,，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子。進口激光熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在JaneliaFa...

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。進口investigato...

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？美國激光雙光子顯微鏡價格后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7,、8,、9...

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實驗中,，時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制,。盡管在單點掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,，這主要是多聚焦成像和單點掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,，引入圖像掃描技術(shù)可以進一步提高空間分辨率,，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現(xiàn)。除此之外,，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會產(chǎn)生光漂白,，因而為了延長觀察時間,，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?。美國investigato...

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來,，不斷發(fā)展,，促進生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn)，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門,。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,?？茖W(xué)進入21世紀，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細胞和組織,，需要能夠更真實地探索生命,，在體內(nèi)實時觀察細胞的發(fā)生和變化。此時,，雙光子顯微鏡進入了科學(xué)家的視野,。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高,，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中...

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點,，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中,，它能對樣品進行三維觀察，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價值,。我們可以相信,，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術(shù)的不斷結(jié)合,，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。雙光子顯...

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。用雙光...

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克,，適于佩戴在小動物頭部顱窗上,，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號,。在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測,。相比單光子激發(fā),，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm,，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的,、美國腦科學(xué)計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡,。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達40Hz（256*256像素）,，同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力,。此外，采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光...

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說,，每個時刻,，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,，一個個點的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信...

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原...